肝癌发生与转移两重要分子MDK和GOLPH2的临床意义及功能分析

【摘要】肝细胞肝癌(简称肝癌)是世界上最常见、恶性度最高的肿瘤之一,位居全球恶性肿瘤发病率第6位、死因第3位,是我国恶性肿瘤第2位死因。尽管近几十年来对肝癌的基础研究和诊断治疗都取得了显著进步,但肝癌患者的总体预后仍差,5年生存率不足5%。导致目前肝癌病人总体预后差的主要原因有两个方面。一是多数患者未能早期发现、早期诊断和早期有效治疗。近年随着肝癌诊断和治疗技术的进步,部分患者通过早期诊断及早期根治切除获得了较好的疗效,5年生存率达50%-60%。但是目前只有10%-20%肝癌病人在诊断时具有根治性治疗的机会。尽管甲胎蛋白(AFP)在肝癌的临床诊断中得到了广泛应用,但其对早期／小肝癌和AFP阴性肝癌的诊断仍存在明显不足,迫切需要新的阳性率和敏感性更高的肝癌诊断指标,以进一步提高肝癌的早期诊断率。肝癌患者预后差的另外一个重要原因是肝癌术后的高转移复发率。据统计肝癌患者术后5年转移复发率高达60%-70%,即使小肝癌亦达40%,转移复发已成为进一步提高肝癌治疗效果的另一个主要障碍。如能探明肝癌转移的分子机理及其关键调控环节,将有助于探索有效的干预措施和治疗手段,以进一步提高肝癌治疗效果、延长病人生存。本所前期采用基因芯片技术比较伴与不伴转移肝癌之间、肝癌转移灶与原发瘤之间基因表达谱的差异,在国际上首次提出促使肝癌转移的基因改变始于原发肿瘤阶段的新观点(YeQH,etal.NatMed2003),为肝癌转移早期预测和分子干预奠定了理论基础。最近,我们进一步将激光捕获显微切割(LCM)和基因芯片技术相结合,研究伴和不伴肝外转移肝癌原发瘤之间基因表达谱的差异,发现了以高尔基体II型膜蛋白GOLPH2(typeIIGolgimembraneprotein)为首的一组可能在肝癌转移进程中起重要作用的候选基因,可能成为肝癌转移的重要干预靶点。同时,我们还通过生物信息学分析方法在全基因组范围内筛选出5个在肝癌组织中高表达的基因：MDK、PEG10.GPC3,SERPINI1和QP-C,其联合组织检测对肝癌诊断的敏感性达84%(包括AFP阴性肝癌和小肝癌)。其中MDK为分泌性蛋白,可在血清中检测,有望成为新的肝癌早期诊断血清学标记物(JaHL,etal.ClinCancerRes2007)。基于此,本课题首先通过大样本、多中心检测血清MDK在肝癌、特别是AFP阴性肝癌和小肝癌中的表达,分析其在肝癌早期诊断中的价值及其临床意义。同时,对高尔基体膜蛋白GOLPH2在肝癌转移进程中的重要作用及其关键调控环节进行系统研究,探讨其作为肝癌转移分子干预靶点的可行性。第一部分血清MDK对甲胎蛋白阴性肝癌和早期肝癌的诊断价值目的：本研究通过检测血清MDK评估其对肝癌特别是AFP阴性肝癌和早期肝癌的临床诊断价值。方法：通过组织芯片免疫组化染色检测105例包含有肝癌及癌旁和肝硬化组织中MDK蛋白水平的表达情况。进一步通过酶联免疫吸附反应(enzyme-linkedimmunosorbentassaysELISAs)定量检测总共501例来自两个临床医学中心包含445位不同受试人群的血清样本(包括肝癌、乙肝肝硬化、肝良性占位、消化道恶性肿瘤和正常人群),结合受试者血清AFP、肿瘤大小和巴塞罗那分期(BCLC),分析血清MDK诊断肝癌特别是AFP阴性肝癌和早期肝癌的敏感性和特异性。结果：免疫组化结果显示,癌组织中MDK表达水平显著高于癌旁及肝硬化无瘤组织(P<0.0001)。与对照组(n=193)相比,测试组HCC(n=84)人群的血清MDK水平(1.346ng/ml;0.864-1.802)明显升高(P=0.0001)；且血清MDK和AFP的受试者工作曲线下面积(AUROC)分别为：0.87和0.69,前者显著高于后者(p<0.000)。在另外一套由163例肝细胞癌患者构成的独立大样本验证队列中(cohortC),以0.752ng/ml作为MDK的诊断阈值,其诊断HCC的敏感性显著高于血清AFP(20ng/m1)(83.3%vs51.2%),而特异性与AFP相近(81.1%vs76.7%)；即便是在AFP阴性(<20ng／m1)肝癌患者中,其敏感性仍可高达82.9%。另外,在诊断早期(BCLC0/A)肝癌患者方面,血清MDK的敏感性(82.3%)亦显著高于AFP(45.2%)。甚至在20例极早期(BCLC0)肝癌患者中,血清MDK的诊断敏感性为AFP的两倍(76.2%vs38.1%),而且两者联合检测能进一步提高极早期肝癌患者的检出率到90%。通过研究患者手术前后及复发前后配对血清MDK水平的变化,发现患者手术后血清MDK明显下降(从术前的1.362±0.362ng/ml降至术后的0.482±0.281ng/ml;P<0.001),而且随访发现,MDK的水平随着患者术后的复发重新升高。结论：血清MDK在肝癌、包括AFP阴性肝癌和早期／极早期肝癌患者中显著升高,可能成为超越AFP的肝癌早期诊断和复发监测新指标。第二部分高尔基体Ⅱ型膜蛋白(GOLPH2)空间调控表皮生长因子受体(EGFR)内吞／循环促进肝癌转移目的：对前期通过激光捕获显微切割和基因表达谱芯片发现的与肝癌转移密切相关的候选基因GOLPH2进行重点研究,明确其在肝癌转移进程中的重要作用及其关键调控环节,探讨其作为肝癌转移分子干预靶点的可行性。方法：运用实时荧光定量PCR技术检测肝癌及其癌旁组织、正常肝组织、高低转移潜能的人肝癌细胞系中GOLPH2的mRNA表达水平,比较分析其表达水平与肝癌转移潜能的关系。进一步通过组织芯片免疫组化染色检测另外一套独立肝癌样本中GOLPH2表达及其与肝癌患者预后的相关性。通过慢病毒介导的RNA干扰/过表达技术及体内外细胞功能试验,验证GOLPH2在肝癌侵袭转移进程中的重要作用。为了进一步研究GOLPH2促进肝癌转移的分子机制,我们还运用IP-PULLDOWN串联质谱分析寻找与GOLPH2可能相互作用的蛋白,并进一步利用免疫共沉淀和激光共聚焦共定位验证相互作用的靶蛋白。最后采用生物素标记的细胞膜分离纯化技术、活细胞分子动态显像技术和Western-blot等技术探讨GOLPH2调节EGFR内吞循环促进肝癌转移的分子机制。结果：RT-PCR结果显示,与癌旁组织和正常肝组织相比,肝癌组织中GOLPH2mRNA表达明显上调(P<0.0001),伴转移肝癌组织中GOLPH2表达较无转移肝癌显著增高(P<0.05),特别在肝癌肝外转移人群中表达更高(P<0.01)。在高转移潜能细胞系中GOLPH2的mRNA和蛋白表达水平均显著高于低转移潜能肝癌细胞株。免疫组化检测结果显示,GOLPH2主要表达于肿瘤组织中,其表达水平的高低与患者的预后相关。GOLPH2低表达患者的至复发时间(TTR)及总体生存(0S)显著高于GOLPH2高表达患者(TTR:P=0.019;OS:P=0007)。多因素分析结果也提示GOLPH2是一个影响肝癌预后的独立因素(P=0.023)。细胞体内和体外基因Gain-andloss研究证实GOLPH2是一个促进肝癌增殖和转移的原癌基因。通过筛选GOLPH2相互作用蛋白发现GOLPH2作为一种主要定位于反式高尔基体(TGN)的膜蛋白能作用于EGFR内吞循环网络,并通过空间调节EGFR内吞循环及下游的信号转导促进肝癌细胞增殖、侵袭和转移。结论：GOLPH2表达与肝癌患者转移和预后相关；GOLPH2通过空间调节EGFR内吞循环及下游的信号转导在肝癌增殖、侵袭和转移进程中起关键作用,可能成为肝癌转移潜在预测指标和重要干预靶点。
【作者】朱文伟；
【导师】钦伦秀；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2011，博士
【关键词】肝细胞癌；早期诊断；转移预测；血清MDK；高尔基体Ⅱ型膜蛋白；表皮生长因子；内吞循环；

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